مقایسه کشت بافت گیاهی و جانوری
کشت بافت گیاهی
یک عبارت کلی برای کشت پروتوپلاست ، سلول ، بافت و اندام گیاهی در شرایط استریل
کشت بافت را می توان از تحقیقات گاتریت 1985 بر روی مواد التبام دهنده زخم های گیاهی و تشکیل کالوس و مطالعات میکروسکوپی توسط اشلیدن 1838 و شوان 1839 که تئوری سلولی را ارئه دادند نسبت دارد در آغاز استفاده از زیر نمونه های حاوی سلول های مریستم نوک ریشه ی گوجه فرنگی و سپس کشت جنین جو و سایر ریز نمونه ها رونق یافت در دوره پیشرفت کشت بافت ، تکنیک های جدید ابداع گردید از جمله آنها می توان استفاده از آب نارگیل ، استفاده از اکسین ، استفاده از سیتوکینین کشت تک سلول و کشت پرستار را نام برد در دوره اخیر به طور قرار دادی کار برروی کشت بافت به 5 گروه تقسیم می شود :
الف ) رفتار سلولی
ب ) تغییر و اصلاح گیاهان
ج ) گیاهان عاری از عوامل بیماری زاد و ذخیره ژرم پلاسم
د ) تکثیر کلون
هـ ) تولید فرآورده
يكي از ويژگی های اغلب موجودات چند سلولی بودن يا به عبارت ديگر تشكيل شدن آن ها از چندين نوع سلول مختلف است. در چنين حالتی سلول ها اغلب جنبه تخصصی به خود مي گيرند. هر چند قادر به انجام تمامی فعاليت هاي مورد نياز موجود زنده به تنهايی نيستند. نتيجه اين تخصصی شدن سلول ها اين است كه موجودات از تعدادی سلول مختلف با اندازه، شكل، ساختار و عملكرد ويژه خود تشكيل مي شوند. بسياری از سلول های موجودات مختلف تحت شرايط خاص قادرند در خارج از اندام و يا بافت اصلی خود به رشد و تكثير خود ادامه دهند. سلول های ايزوله شده، بافت ها يا اندام ها را می توان در ظروف پلاستيكی يا شيشه ای با درجه حرارت های تعريف شده كه در انكوباتور ايجاد می شود نگهداری و تكثير داد در عين حال كه با يك محيط حاوی مواد مغذی و فاكتور های رشد سلولی تغذيه مي شوند. كشت in vitroاندام ها، بافت ها و سلول ها مجموعاً تحت عنوان كشت بافت ناميده می شود كه در بسياری از شاخه های علمی مورد استفاده قرار می گيرد. پيشرفت تكنيك های كشت بافت مديون دو شاخه اصلی از تحقيقات پزشكی يعنی مطالعات سرطانی و ويروس شناسی است.
انواع کشت بافت گیاهی:
1) کشت گیاه کامل: یک بذر ممکن است در شرایط آزمایشگاهی کشت شود و یک گیاهچه و در نهایت یک گیاه کامل تولید کند.
2) کشت جنین: در این نوع کشت، جنین جدا شده و پس از حذف پوسته بذر کشت میشود.
3) کشت اندام گیاهی: در این کشت، انواع مختلفی مثل کشت مریستم، کشت ریشه و کشت نوک ساقه قابل تشخیص هستند.
4) کشت کالوس: اگر یک بافت تمایز یافته جدا شود و در شرایط آزمایشگاهی تولید یک توده سلولی تمایز نیافته به نام کالوس نماید، این پدیده را کشت کالوس مینامند.
5) کشت سلول: کشت سلولهای منفرد که به کمک آنزیمها یا روشهای مکانیکی از یک بافت گیاهی یا سوسپانسیون سلولی بدست میآید.
6) کشت پروتوپلاست: کشت پروتوپلاستهایی که در اثر هضم آنزیمی دیواره سلولی بوجود آمدهاند، کشت پروتوپلاست نام دارد.
مواد موجود در کشت بافت گیاهی:
آب: حدود 95% حجم یک محیط کشت را تشکیل میدهد.
آگار: بعنوان ماده مولد ژل در محیطهای کشت از جمله مواد پرکاربرد و گران قیمت در بیوتکنولوژی گیاهی محسوب میشود.به جز آگار امکان استفاده از سایر منابع طبیعی به منظور تولید ژل در محیطهای کشت وجود دارد. از جمله این مواد، بذور گیاهان دارویی با قابلیت تولید موسیلاژ است.
هورمونها: شامل اکسن و سیتوکنین
مواد معدنی
به طور كلي امتيازهاي روش ريزازديادي را مي توان در موارد زير خلاصه كرد:
1- گياهان تكثير شده به روش كشت بافت از قدرت رشد بالايي نسبت به گياهاني كه به روش هاي سنتي تكثير ميشوند برخوردارند.
2- ازدياد آن گروه از گياهاني كه با روش هاي سنتي به سختي تكثير شده و يا از نظر اقتصادي مقرون به صرفه نيستند.
3- تكثير و توليد تعداد زيادي از كلون هاي با ژنتيك معين.
4- بذور از ريسك كمتري براي جوانه زدن برخوردارند.
5- آزاد شدن از قيود اقليمي موجود از نظر فصل و زيستگاه و در تمام طول سال مي توان گياه توليد كرد.
6- حمل و نقل مواد گياهي را راحت تر مي كند.
7- نگهداري دراز مدت و ميان مواد گياهي.
8- تكنيك هاي كشت بافت در توليد گياهان عاري از ويروس، دستكاري ژنتيكي، هيبريداسيون سوماتيكي، اصلاح نباتات و مطالعات پايه استفاده مي شوند.
كشت سلول يا بافت يك تكنيك جديد نيست. در متون علمی منابعی وجود دارد كه تاريخ آن ها به سال 1885 بر می گردد. يك جنين شناس به نام Roux، توانست جنين يك جوجه را به مدت چند روز در ظرف محتوی محلول بافر نمكی گرم نگهداری نمايد. اين اولين مورد ثبت شده از موفقيت در رشد و تكثير يك بافت در خارج از بدن بود. در سال 1903 Jolly مشاهدات خود را در ارتباط با زنده ماندن سلول در محيط in vitro و تقسيم سلولی با استفاده از لوكوسيتهای سمندر به تفصيل بازگو نمود. چون در آزمايشات اوليه قسمت هايی از بافت مورد مطالعه قرار می گرفتند، عنوان كشت بافت به آن اطلاق شد. معمولاً اصطلاح كشت بافت زمانيكه سلول ها براي مدتی بيش از 24 ساعت در شرايط in vitro نگهداری شوند مورد استفاده قرار می گيرد. توسعه كشت سلول های حيوانی به كار های Ross Harrison در سال 1907 بر روی سلول های بافت جنين قورباغه باز می گردد. در ابتدا سلول ها و بافت ها در مايع لنفی و بعد ها پلاسمايی كشت داده می شدند. در سال 1912 Carrel توانست سلولهای بافت پیوندی قلبی جنين جوجه را به مدت طولانی کشت دهد. در سال 1952 از سرطان رحم، اولین لاین سلول انسانی به نام Hela را بدست آوردند كه انقلابی را در زمينه كشت سلول به وجود آورد. در سال 1955 Eegle و بعدها دیگران قادر شدند محیطهای کشت مناسب، فاکتورهای اتصال و لایه تغذیه کننده برای سلول را شناسایی کنند و به اين ترتيب فرمولاسيون های مواد مغذی جايگزين فراورده های بيولوژيك مثل سرم و لنف گرديد. در سال 1962 روشهایی برای نگهداری سلولهای مشتق از منشأ توموری ارائه گرديد. در سال 1968 تمایز میوبلاستهای طبیعی در شرایط in vitro مطالعه شد. در دهه 70 روشهای رشد سلولهای خاص در محیطی حاوی ترکیبات شیمیای ارائه گردید و Gardon Sato و همکارانش احتیاجات سلول به فاکتور رشد پروتئینی، فاکتورهای اتصال نظیر گلیکوپروتئینهای با وزن مولکولی بالا در ماتریکس خارج سلول و هورمونهایی نظیر انسولین و فاکتورهای رشد شبه انسولینی را تشریح کردند. در سال 1979 Sato همكاران ترکیبات محیط کشت بدون سرم برای سلول عصبی را نيز مشخص نمودند. و بعدها تحقیقات زیادی با استفاده از تكنيك هاي کشت سلولي گسترش یافت.
کشت بافت به عنوان یک اصطلاح عمومی که شامل کشت in vitro اندام ها، بافت ها و سلول ها است مورد استفاده قرار می گیرد. اساساً این اصطلاح محدود به سلول های حیوانی نمی شود، بلکه شامل کشت in vitro سلول های گیاهی نیز می باشد.
کشت بافت جانوری به 3 دسته اصلی طبقه بندی می شود؛ کشت اندام ( Organ culture )، کشت ریز نمونه ( Explant culture ) و کشت سلول ( Cell culture ).
کشت اندام
کشت اندام در واقع یک کشت 3 بعدی است از قسمتی یا تمام یک اندام به همان شکل بافت شناختی که در حالت طبیعی یا in vivo مشاهده می شود. تمام اندام یا بخشی از آن در مسیری که امکان تمایز و حفاظت از فرم طبیعی و اصلی آن وجود دارد، نگهداری می شود و اینکار معمولاً با کشت اندام مورد نظر در گاز مایع بر روی گرید ( شبکه ) یا ژل صورت می گیرد.
یک سری موانع بر سر راه کشت اندام وجود دارد. اندام ها قادر به تکثیر شدن نیستند و بنابراین هر قسمتی از بافت فقط یک بار می تواند مورد استفاده قرار گیرد که در نتیجه دستیابی به یک پاسخ تکثیری را با مشکل مواجه می سازد. البته سلول های انفرادی ممکن است چنین پاسخی را ایجاد کنند اما از آنجا که تعداد این سلول ها در قسمت مورد نظر از بافت بسیار اندک است، شناسایی و ارزیابی این پاسخ ها به سختی صورت می گیرد. به علاوه، به دلیل عدم وجود یک سیستم عروقی عملکردی، امکان فراهم آوردن اکسیژن و مواد غذایی کافی در بافت وجود ندارد. این مشکل با نگهداری اندام در کشت های روزنه ای ( Stirred culture ) یا بطری های گردان ( Roller bottle ) که به تناوب هوا و مواد مغذی محلول را فراهم می آورند تا حدودی برطرف می شود.
کشت ریز نمونه
در کشت ریز نمونه، قطعات کوچکی از بافت مورد نظر امکان اتصال به یک محیط زمینه ای را پیدا می کنند که این محیط زمینه معمولاً با کلاژن پوشش دار شده است و ریز نمونهه ها در یک محیط غنی که معمولاً حاوی مقداری سرم نیز است رشد می یابند. به دنبال چنین اتصالی، مهاجرت سلول در سطح ماده زمینه ای جامد هدایت می شود. معمولا ریز نمونه ها را در حفراتی در یک اسلاید ضخیم شیشه ای که به وسیله یک لامل کاملا مهروموم شده است نگهداری می کردند که این تکنیک هم اکنون نیز مورد استفاده قرار می گیرد. اخیراً به دلیل سهولت از ظروف کشت متداول استفاده می شود. با این تکنیک کشت، بافت های نابالغ بهتر رشد می کنند و ریز نمونه ها به طور معمول در این حالت از بافت های جنینی تهیه می شوند. به طور تیپیک، بافت به وسیله اسکالپل به قطعاتی با ضخامت 5/0 تا 1 میلی متر قطعه قطعه می شود، اما در برخی موارد این قطعه شدن به آسانی با گذراندن بافت از یک شبکه ( مش ) نایلونی صورت می گیرد. نیاز به نشت یا گسترش مواد غذایی و اکسیژن به قسمت مرکزی ریز نمونه، ضخامت این قطعات را در حد میلی متر محدود نموده است.
بر اساس تجربیات محققان، کشت های ریز نمونه قادرند برای ماه ها تگهداری شوند و سلول های درون ریز نمونه به رشد و نمو خود کم و بیش ادامه خواهند داد. یکی از فواید اصلی این شیوه این است که برخی از جنبه های ساختاری بافت ها درون ریز نمونه حفظ خواهد شد.
کشت سلول
منظور از کشت سلول، کشت سلول های استخراج شده از بافت اصلی ( کشت سلول ابتدایی ) است. سلول ها به شکل یک سوسپانسیون سلولی ( به طور مکانیکی یا آنزیمی ) در آمده و سپس ممکن است به طور تک لایه بر روی یک سطح جامد، یا به صورت سوسپانسیون در محیط کشت در آید. این کشت ها ساختار ظاهری خود را از دست داده اند و اغلب با یک سری تغییرات بیوشیمیایی همراه می باشند. به هر حال، این سلول ها قادر به تکثیرند و بنابراین رشد کرده و تقسیم می شوند و در نتیجه نیاز به تکرار کشت یا همان پاساژ سلولی می باشند. کشت سلولی به صورت جمعیت مشخصی از سلول ها است که می توان آن را با فریز نمودن حفظ نمود.
file:///C:/Users/novin/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image001.gif
امروزه تنوع بسیار وسیعی از محیط های کشت در دسترس قرار دارد که انتخاب محیط کشت به احتیاجات سلول ها وابسته است. محتوای یک محیط کشت مناسب شامل:
محیط پایه
اساسی ترین محیط های کشت پایه محلول های متوازن نمکی ( BSS ) هستند. برای مثال Phosphate buffered saline یا PBS که می تواند هم جهت شستشوی سلول ها و هم برای انکوباسیون کوتاه مدت در سسوسپانسیون مورد استفاده قرار گیرد. بیشتر محیط های ترکیبی تعریف شده برای رشد و نگهداری طولانی مدت سلول ها استفاده می شوند. محیط های کشت شناخته شده با اضافه نمودن تعدادی از عناصر سازنده می توانند در بیچیدگی نیز متنوع باشند. برای مثال Eagle’s minimum essential medium یا MEM که حاوی آمینو اسید های ضروری، ویتامین ها و نمک ها است نسبت به محیط McCoy’s که حاوی تعداد بیشتری آمینو اسید های مختلف، ویتامین ها، مواد معدنی و دیگر متابولیت های اضافی ( مثل نوکلئوزید ها ) است.
ظرفیت بافری
جهت انجام کشت سلولی لازم است تا تعدادی از مواد مغذی به محیط کشت پایه اضافه گردد. کشت های سلولی یک PH بهینه برای رشد دارند که معمولاً بین 4/7 تا 7/7 است. توع سیستم بافری مورد استفاده به شرایط محیط کشت بستگی دارد. وقتی سلول ها در یک اتمسفر حاوی CO2 انکوباسیون می شوند، یک موازنه ای باید بین محیط کشت و فاز گازی حفظ شود. سیستم بافری بیکربنات- CO2 به دلیل داشتن کمترین میزان سمیت برای سلول ها بیشتر از سایرین مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین بافر دیگری که ممکن است مورد استفاده قرار گیرد HEPES با خاصیت بافری بسیار قوی تر است.
هر نوع محیط به غلظت مشخصی ار بیکربنات و CO2 برای رسیدن به PH و اسمولالیته صحیح نیازمند است. بافر HEPES به طور نرمال باید در پیوند با بی کربنات مورد استفاده قرار گیرد، چراکه ارتباط موجود بین HEPES و بی کربنات سطوح مختلف CO2 مورد نیاز را تعین می کند. اگرچه HEPES به تنهایی می تواند PH را در غیاب CO2 خارجی حفظ نماید. اضافه نمودن 1 الی 5 میلی مول پیرووات به محیط نیز، تولیدات داخل سلولی حاصل از CO2 را افزایش داده و نیاز به CO2 اتمسفری را محدود می نماید. برخی محیط های شناخته شده به همین منظور ساخته شده اند، برای مثال محیط کشت Leibovitz L15 . همچنین سلول هایی که مقادیر بالایی از CO2 را تحت شرایط خاص انکوباسیون تولید می کنند ممکن است به HEPES جهت بافرینگ CO2 تولید شده نیاز داشته باشند.
غلظت کشت می تواند نیاز CO2 را تحت تأثیر قرار دهد. به هر حال، عموماً فنل رد در محیط شرایط PH را در هر زمانی مشخص خواهد نمود.
گلوتامین و آمینو اسید ها
علاوه بر سیستم بافری برای محیط کشت، ملزومات دیگری مانند آمینواسید ها برای رشد وجود دارند که با توجه به نوع سلول می تواند بسیار متنوع باشند. معمولاً آمینواسید های ضروری شامل سیستئین و تایروزین می شوند اما ممکن است برخی آمینواسید های غیر ضروری هم مورد نیاز باشند. گلوتامین هم برای بیشتر لاین های سلولی مورد نیاز است و پیشنهاد شده است که سلول های کشت شده گلوتامین را به عنوان یک منبع انرژی و منبع کربن به گلوکوز ترجیح دهند، هر چند گلوکوز در بیشتر محیط های تعریف شده وجود دارد. گلوتامین معمولاً در غلظت نهایی 2 میلی مولار اضافه می شود. اگر چه یکبار اضافه کردن گلوتامین به محیط تنها به مدت 3 هفته در 4 درجه سانتی گراد پایداری دارد.
سرم
اگرچه تحقیقات زیادی با هدف کاهش نیازمندی سلول ها به سرم به وسیله جیگزینی آن با مواد مغذی دیگر در محیط صورت گرفته است اما به نظر می رسد که لاین های سلولی همچنان برای رشد مناسب خود به سرم نیازمند باشند. منابع متنوعی برای تهیه سرم وجود دارند مانند گوساله، جنین گوساله و اسب. اغلب سرم جنین گوساله بهترین شرایط رشدی را در محیط کشت سلول فراهم می کند. سطح مورد استفاده سرم اختصاصاً به نوع لاین سلولی بستگی دارد و باید به صورت تجربی مشخص گردد. بچ های سرمی ممکن است به طور قابل ملاحظه ای در توانایی شان جهت حمایت رشد سلولی متنوع باشند. بنابراین نست کردن بچ های سرمی از این لحاظ اهمیت دارد. برای چک کردن مشخصات و ویژگی های بچ های سرمی، میزان کونینگ و مختصات رشدی ( مورفولوژی، الگوی رشد) باید در غلظتی از سرم بین 2 تا 20 درصد انجام شود. این محدوده غلظت در صورتی که تغییراتی در غلظت سرم به منظور بهینه کردن ویژگی های رشدی برای یک لاین سلولی خاص صورت گیرد، بیشتر خواهد شد.
آنتی بیوتیک ها و آنتی مایکوتیک ها
در صورت مناسب نبودن شرایط استریلیتی ( برای مثال: نبودن هود های لامینار ) استفاده از آنتی بیوتیک ها و آنتی مایکوتیک ها در محیط کشت ضروری به نظر می رسد. طیف وسیعی از آنتی بیوتیک های نسبتاً خاص وجود دارد از جمله محلول های پنی سیلین و استروپتومایسین، که به منظور عریض تر نمودن طیف، از مواد آنتی باکتریال و آنتی مایکوتیکال دیگر مثل کانامایسین یا آمفوترین B استفاده می شوند. آنتی بیوتیک انتخابی باید مشخصاً فاقد اثرات سمی برای سلول کشت شده باشد و بسته به نوع آلودگی انتخاب می شود.
کشت سلول حیوانی برای طیف وسیعی از تحقیقات و توسعه مورد استفاده قرار میگیرد:
1) تولید واکسن ضدویروس
2) تحقیقات سرطان
3) دستکاری ژنتیکی
4) تولید آنتیبادیهای مونوکلونال
5) تولید دارو
6) آنالیز کروموزومها
7) بررسی اثرات سموم و آلایندهها
8) تولید سلولهای هیبرید
کشت بافت گیاهی
یک عبارت کلی برای کشت پروتوپلاست ، سلول ، بافت و اندام گیاهی در شرایط استریل
کشت بافت را می توان از تحقیقات گاتریت 1985 بر روی مواد التبام دهنده زخم های گیاهی و تشکیل کالوس و مطالعات میکروسکوپی توسط اشلیدن 1838 و شوان 1839 که تئوری سلولی را ارئه دادند نسبت دارد در آغاز استفاده از زیر نمونه های حاوی سلول های مریستم نوک ریشه ی گوجه فرنگی و سپس کشت جنین جو و سایر ریز نمونه ها رونق یافت در دوره پیشرفت کشت بافت ، تکنیک های جدید ابداع گردید از جمله آنها می توان استفاده از آب نارگیل ، استفاده از اکسین ، استفاده از سیتوکینین کشت تک سلول و کشت پرستار را نام برد در دوره اخیر به طور قرار دادی کار برروی کشت بافت به 5 گروه تقسیم می شود :
الف ) رفتار سلولی
ب ) تغییر و اصلاح گیاهان
ج ) گیاهان عاری از عوامل بیماری زاد و ذخیره ژرم پلاسم
د ) تکثیر کلون
هـ ) تولید فرآورده
يكي از ويژگی های اغلب موجودات چند سلولی بودن يا به عبارت ديگر تشكيل شدن آن ها از چندين نوع سلول مختلف است. در چنين حالتی سلول ها اغلب جنبه تخصصی به خود مي گيرند. هر چند قادر به انجام تمامی فعاليت هاي مورد نياز موجود زنده به تنهايی نيستند. نتيجه اين تخصصی شدن سلول ها اين است كه موجودات از تعدادی سلول مختلف با اندازه، شكل، ساختار و عملكرد ويژه خود تشكيل مي شوند. بسياری از سلول های موجودات مختلف تحت شرايط خاص قادرند در خارج از اندام و يا بافت اصلی خود به رشد و تكثير خود ادامه دهند. سلول های ايزوله شده، بافت ها يا اندام ها را می توان در ظروف پلاستيكی يا شيشه ای با درجه حرارت های تعريف شده كه در انكوباتور ايجاد می شود نگهداری و تكثير داد در عين حال كه با يك محيط حاوی مواد مغذی و فاكتور های رشد سلولی تغذيه مي شوند. كشت in vitroاندام ها، بافت ها و سلول ها مجموعاً تحت عنوان كشت بافت ناميده می شود كه در بسياری از شاخه های علمی مورد استفاده قرار می گيرد. پيشرفت تكنيك های كشت بافت مديون دو شاخه اصلی از تحقيقات پزشكی يعنی مطالعات سرطانی و ويروس شناسی است.
انواع کشت بافت گیاهی:
1) کشت گیاه کامل: یک بذر ممکن است در شرایط آزمایشگاهی کشت شود و یک گیاهچه و در نهایت یک گیاه کامل تولید کند.
2) کشت جنین: در این نوع کشت، جنین جدا شده و پس از حذف پوسته بذر کشت میشود.
3) کشت اندام گیاهی: در این کشت، انواع مختلفی مثل کشت مریستم، کشت ریشه و کشت نوک ساقه قابل تشخیص هستند.
4) کشت کالوس: اگر یک بافت تمایز یافته جدا شود و در شرایط آزمایشگاهی تولید یک توده سلولی تمایز نیافته به نام کالوس نماید، این پدیده را کشت کالوس مینامند.
5) کشت سلول: کشت سلولهای منفرد که به کمک آنزیمها یا روشهای مکانیکی از یک بافت گیاهی یا سوسپانسیون سلولی بدست میآید.
6) کشت پروتوپلاست: کشت پروتوپلاستهایی که در اثر هضم آنزیمی دیواره سلولی بوجود آمدهاند، کشت پروتوپلاست نام دارد.
مواد موجود در کشت بافت گیاهی:
آب: حدود 95% حجم یک محیط کشت را تشکیل میدهد.
آگار: بعنوان ماده مولد ژل در محیطهای کشت از جمله مواد پرکاربرد و گران قیمت در بیوتکنولوژی گیاهی محسوب میشود.به جز آگار امکان استفاده از سایر منابع طبیعی به منظور تولید ژل در محیطهای کشت وجود دارد. از جمله این مواد، بذور گیاهان دارویی با قابلیت تولید موسیلاژ است.
هورمونها: شامل اکسن و سیتوکنین
مواد معدنی
به طور كلي امتيازهاي روش ريزازديادي را مي توان در موارد زير خلاصه كرد:
1- گياهان تكثير شده به روش كشت بافت از قدرت رشد بالايي نسبت به گياهاني كه به روش هاي سنتي تكثير ميشوند برخوردارند.
2- ازدياد آن گروه از گياهاني كه با روش هاي سنتي به سختي تكثير شده و يا از نظر اقتصادي مقرون به صرفه نيستند.
3- تكثير و توليد تعداد زيادي از كلون هاي با ژنتيك معين.
4- بذور از ريسك كمتري براي جوانه زدن برخوردارند.
5- آزاد شدن از قيود اقليمي موجود از نظر فصل و زيستگاه و در تمام طول سال مي توان گياه توليد كرد.
6- حمل و نقل مواد گياهي را راحت تر مي كند.
7- نگهداري دراز مدت و ميان مواد گياهي.
8- تكنيك هاي كشت بافت در توليد گياهان عاري از ويروس، دستكاري ژنتيكي، هيبريداسيون سوماتيكي، اصلاح نباتات و مطالعات پايه استفاده مي شوند.
كشت سلول يا بافت يك تكنيك جديد نيست. در متون علمی منابعی وجود دارد كه تاريخ آن ها به سال 1885 بر می گردد. يك جنين شناس به نام Roux، توانست جنين يك جوجه را به مدت چند روز در ظرف محتوی محلول بافر نمكی گرم نگهداری نمايد. اين اولين مورد ثبت شده از موفقيت در رشد و تكثير يك بافت در خارج از بدن بود. در سال 1903 Jolly مشاهدات خود را در ارتباط با زنده ماندن سلول در محيط in vitro و تقسيم سلولی با استفاده از لوكوسيتهای سمندر به تفصيل بازگو نمود. چون در آزمايشات اوليه قسمت هايی از بافت مورد مطالعه قرار می گرفتند، عنوان كشت بافت به آن اطلاق شد. معمولاً اصطلاح كشت بافت زمانيكه سلول ها براي مدتی بيش از 24 ساعت در شرايط in vitro نگهداری شوند مورد استفاده قرار می گيرد. توسعه كشت سلول های حيوانی به كار های Ross Harrison در سال 1907 بر روی سلول های بافت جنين قورباغه باز می گردد. در ابتدا سلول ها و بافت ها در مايع لنفی و بعد ها پلاسمايی كشت داده می شدند. در سال 1912 Carrel توانست سلولهای بافت پیوندی قلبی جنين جوجه را به مدت طولانی کشت دهد. در سال 1952 از سرطان رحم، اولین لاین سلول انسانی به نام Hela را بدست آوردند كه انقلابی را در زمينه كشت سلول به وجود آورد. در سال 1955 Eegle و بعدها دیگران قادر شدند محیطهای کشت مناسب، فاکتورهای اتصال و لایه تغذیه کننده برای سلول را شناسایی کنند و به اين ترتيب فرمولاسيون های مواد مغذی جايگزين فراورده های بيولوژيك مثل سرم و لنف گرديد. در سال 1962 روشهایی برای نگهداری سلولهای مشتق از منشأ توموری ارائه گرديد. در سال 1968 تمایز میوبلاستهای طبیعی در شرایط in vitro مطالعه شد. در دهه 70 روشهای رشد سلولهای خاص در محیطی حاوی ترکیبات شیمیای ارائه گردید و Gardon Sato و همکارانش احتیاجات سلول به فاکتور رشد پروتئینی، فاکتورهای اتصال نظیر گلیکوپروتئینهای با وزن مولکولی بالا در ماتریکس خارج سلول و هورمونهایی نظیر انسولین و فاکتورهای رشد شبه انسولینی را تشریح کردند. در سال 1979 Sato همكاران ترکیبات محیط کشت بدون سرم برای سلول عصبی را نيز مشخص نمودند. و بعدها تحقیقات زیادی با استفاده از تكنيك هاي کشت سلولي گسترش یافت.
کشت بافت به عنوان یک اصطلاح عمومی که شامل کشت in vitro اندام ها، بافت ها و سلول ها است مورد استفاده قرار می گیرد. اساساً این اصطلاح محدود به سلول های حیوانی نمی شود، بلکه شامل کشت in vitro سلول های گیاهی نیز می باشد.
کشت بافت جانوری به 3 دسته اصلی طبقه بندی می شود؛ کشت اندام ( Organ culture )، کشت ریز نمونه ( Explant culture ) و کشت سلول ( Cell culture ).
کشت اندام
کشت اندام در واقع یک کشت 3 بعدی است از قسمتی یا تمام یک اندام به همان شکل بافت شناختی که در حالت طبیعی یا in vivo مشاهده می شود. تمام اندام یا بخشی از آن در مسیری که امکان تمایز و حفاظت از فرم طبیعی و اصلی آن وجود دارد، نگهداری می شود و اینکار معمولاً با کشت اندام مورد نظر در گاز مایع بر روی گرید ( شبکه ) یا ژل صورت می گیرد.
یک سری موانع بر سر راه کشت اندام وجود دارد. اندام ها قادر به تکثیر شدن نیستند و بنابراین هر قسمتی از بافت فقط یک بار می تواند مورد استفاده قرار گیرد که در نتیجه دستیابی به یک پاسخ تکثیری را با مشکل مواجه می سازد. البته سلول های انفرادی ممکن است چنین پاسخی را ایجاد کنند اما از آنجا که تعداد این سلول ها در قسمت مورد نظر از بافت بسیار اندک است، شناسایی و ارزیابی این پاسخ ها به سختی صورت می گیرد. به علاوه، به دلیل عدم وجود یک سیستم عروقی عملکردی، امکان فراهم آوردن اکسیژن و مواد غذایی کافی در بافت وجود ندارد. این مشکل با نگهداری اندام در کشت های روزنه ای ( Stirred culture ) یا بطری های گردان ( Roller bottle ) که به تناوب هوا و مواد مغذی محلول را فراهم می آورند تا حدودی برطرف می شود.
کشت ریز نمونه
در کشت ریز نمونه، قطعات کوچکی از بافت مورد نظر امکان اتصال به یک محیط زمینه ای را پیدا می کنند که این محیط زمینه معمولاً با کلاژن پوشش دار شده است و ریز نمونهه ها در یک محیط غنی که معمولاً حاوی مقداری سرم نیز است رشد می یابند. به دنبال چنین اتصالی، مهاجرت سلول در سطح ماده زمینه ای جامد هدایت می شود. معمولا ریز نمونه ها را در حفراتی در یک اسلاید ضخیم شیشه ای که به وسیله یک لامل کاملا مهروموم شده است نگهداری می کردند که این تکنیک هم اکنون نیز مورد استفاده قرار می گیرد. اخیراً به دلیل سهولت از ظروف کشت متداول استفاده می شود. با این تکنیک کشت، بافت های نابالغ بهتر رشد می کنند و ریز نمونه ها به طور معمول در این حالت از بافت های جنینی تهیه می شوند. به طور تیپیک، بافت به وسیله اسکالپل به قطعاتی با ضخامت 5/0 تا 1 میلی متر قطعه قطعه می شود، اما در برخی موارد این قطعه شدن به آسانی با گذراندن بافت از یک شبکه ( مش ) نایلونی صورت می گیرد. نیاز به نشت یا گسترش مواد غذایی و اکسیژن به قسمت مرکزی ریز نمونه، ضخامت این قطعات را در حد میلی متر محدود نموده است.
بر اساس تجربیات محققان، کشت های ریز نمونه قادرند برای ماه ها تگهداری شوند و سلول های درون ریز نمونه به رشد و نمو خود کم و بیش ادامه خواهند داد. یکی از فواید اصلی این شیوه این است که برخی از جنبه های ساختاری بافت ها درون ریز نمونه حفظ خواهد شد.
کشت سلول
منظور از کشت سلول، کشت سلول های استخراج شده از بافت اصلی ( کشت سلول ابتدایی ) است. سلول ها به شکل یک سوسپانسیون سلولی ( به طور مکانیکی یا آنزیمی ) در آمده و سپس ممکن است به طور تک لایه بر روی یک سطح جامد، یا به صورت سوسپانسیون در محیط کشت در آید. این کشت ها ساختار ظاهری خود را از دست داده اند و اغلب با یک سری تغییرات بیوشیمیایی همراه می باشند. به هر حال، این سلول ها قادر به تکثیرند و بنابراین رشد کرده و تقسیم می شوند و در نتیجه نیاز به تکرار کشت یا همان پاساژ سلولی می باشند. کشت سلولی به صورت جمعیت مشخصی از سلول ها است که می توان آن را با فریز نمودن حفظ نمود.
file:///C:/Users/novin/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image001.gif
امروزه تنوع بسیار وسیعی از محیط های کشت در دسترس قرار دارد که انتخاب محیط کشت به احتیاجات سلول ها وابسته است. محتوای یک محیط کشت مناسب شامل:
محیط پایه
اساسی ترین محیط های کشت پایه محلول های متوازن نمکی ( BSS ) هستند. برای مثال Phosphate buffered saline یا PBS که می تواند هم جهت شستشوی سلول ها و هم برای انکوباسیون کوتاه مدت در سسوسپانسیون مورد استفاده قرار گیرد. بیشتر محیط های ترکیبی تعریف شده برای رشد و نگهداری طولانی مدت سلول ها استفاده می شوند. محیط های کشت شناخته شده با اضافه نمودن تعدادی از عناصر سازنده می توانند در بیچیدگی نیز متنوع باشند. برای مثال Eagle’s minimum essential medium یا MEM که حاوی آمینو اسید های ضروری، ویتامین ها و نمک ها است نسبت به محیط McCoy’s که حاوی تعداد بیشتری آمینو اسید های مختلف، ویتامین ها، مواد معدنی و دیگر متابولیت های اضافی ( مثل نوکلئوزید ها ) است.
ظرفیت بافری
جهت انجام کشت سلولی لازم است تا تعدادی از مواد مغذی به محیط کشت پایه اضافه گردد. کشت های سلولی یک PH بهینه برای رشد دارند که معمولاً بین 4/7 تا 7/7 است. توع سیستم بافری مورد استفاده به شرایط محیط کشت بستگی دارد. وقتی سلول ها در یک اتمسفر حاوی CO2 انکوباسیون می شوند، یک موازنه ای باید بین محیط کشت و فاز گازی حفظ شود. سیستم بافری بیکربنات- CO2 به دلیل داشتن کمترین میزان سمیت برای سلول ها بیشتر از سایرین مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین بافر دیگری که ممکن است مورد استفاده قرار گیرد HEPES با خاصیت بافری بسیار قوی تر است.
هر نوع محیط به غلظت مشخصی ار بیکربنات و CO2 برای رسیدن به PH و اسمولالیته صحیح نیازمند است. بافر HEPES به طور نرمال باید در پیوند با بی کربنات مورد استفاده قرار گیرد، چراکه ارتباط موجود بین HEPES و بی کربنات سطوح مختلف CO2 مورد نیاز را تعین می کند. اگرچه HEPES به تنهایی می تواند PH را در غیاب CO2 خارجی حفظ نماید. اضافه نمودن 1 الی 5 میلی مول پیرووات به محیط نیز، تولیدات داخل سلولی حاصل از CO2 را افزایش داده و نیاز به CO2 اتمسفری را محدود می نماید. برخی محیط های شناخته شده به همین منظور ساخته شده اند، برای مثال محیط کشت Leibovitz L15 . همچنین سلول هایی که مقادیر بالایی از CO2 را تحت شرایط خاص انکوباسیون تولید می کنند ممکن است به HEPES جهت بافرینگ CO2 تولید شده نیاز داشته باشند.
غلظت کشت می تواند نیاز CO2 را تحت تأثیر قرار دهد. به هر حال، عموماً فنل رد در محیط شرایط PH را در هر زمانی مشخص خواهد نمود.
گلوتامین و آمینو اسید ها
علاوه بر سیستم بافری برای محیط کشت، ملزومات دیگری مانند آمینواسید ها برای رشد وجود دارند که با توجه به نوع سلول می تواند بسیار متنوع باشند. معمولاً آمینواسید های ضروری شامل سیستئین و تایروزین می شوند اما ممکن است برخی آمینواسید های غیر ضروری هم مورد نیاز باشند. گلوتامین هم برای بیشتر لاین های سلولی مورد نیاز است و پیشنهاد شده است که سلول های کشت شده گلوتامین را به عنوان یک منبع انرژی و منبع کربن به گلوکوز ترجیح دهند، هر چند گلوکوز در بیشتر محیط های تعریف شده وجود دارد. گلوتامین معمولاً در غلظت نهایی 2 میلی مولار اضافه می شود. اگر چه یکبار اضافه کردن گلوتامین به محیط تنها به مدت 3 هفته در 4 درجه سانتی گراد پایداری دارد.
سرم
اگرچه تحقیقات زیادی با هدف کاهش نیازمندی سلول ها به سرم به وسیله جیگزینی آن با مواد مغذی دیگر در محیط صورت گرفته است اما به نظر می رسد که لاین های سلولی همچنان برای رشد مناسب خود به سرم نیازمند باشند. منابع متنوعی برای تهیه سرم وجود دارند مانند گوساله، جنین گوساله و اسب. اغلب سرم جنین گوساله بهترین شرایط رشدی را در محیط کشت سلول فراهم می کند. سطح مورد استفاده سرم اختصاصاً به نوع لاین سلولی بستگی دارد و باید به صورت تجربی مشخص گردد. بچ های سرمی ممکن است به طور قابل ملاحظه ای در توانایی شان جهت حمایت رشد سلولی متنوع باشند. بنابراین نست کردن بچ های سرمی از این لحاظ اهمیت دارد. برای چک کردن مشخصات و ویژگی های بچ های سرمی، میزان کونینگ و مختصات رشدی ( مورفولوژی، الگوی رشد) باید در غلظتی از سرم بین 2 تا 20 درصد انجام شود. این محدوده غلظت در صورتی که تغییراتی در غلظت سرم به منظور بهینه کردن ویژگی های رشدی برای یک لاین سلولی خاص صورت گیرد، بیشتر خواهد شد.
آنتی بیوتیک ها و آنتی مایکوتیک ها
در صورت مناسب نبودن شرایط استریلیتی ( برای مثال: نبودن هود های لامینار ) استفاده از آنتی بیوتیک ها و آنتی مایکوتیک ها در محیط کشت ضروری به نظر می رسد. طیف وسیعی از آنتی بیوتیک های نسبتاً خاص وجود دارد از جمله محلول های پنی سیلین و استروپتومایسین، که به منظور عریض تر نمودن طیف، از مواد آنتی باکتریال و آنتی مایکوتیکال دیگر مثل کانامایسین یا آمفوترین B استفاده می شوند. آنتی بیوتیک انتخابی باید مشخصاً فاقد اثرات سمی برای سلول کشت شده باشد و بسته به نوع آلودگی انتخاب می شود.
کشت سلول حیوانی برای طیف وسیعی از تحقیقات و توسعه مورد استفاده قرار میگیرد:
1) تولید واکسن ضدویروس
2) تحقیقات سرطان
3) دستکاری ژنتیکی
4) تولید آنتیبادیهای مونوکلونال
5) تولید دارو
6) آنالیز کروموزومها
7) بررسی اثرات سموم و آلایندهها
8) تولید سلولهای هیبرید